Доброй традицией Нобелевского комитета становится признание значимости методик, позволяющих «разглядеть» отдельные атомы: в 2014 году отметили сверхразрешающую микроскопию , а 4 октября 2017 года Нобелевскую премию по химии присудили «за разработку метода криоэлектронной микроскопии». Лауреатами стали трое исследователей: Жак Дюбоше из Университета Лозанны, Йохим Франк из Колумбийского университета в Нью-Йорке и Ричард Хендерсон из Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже. Заморозка биомолекул в движении позволяет получать их изображения в высоком разрешении, а методики компьютерной реконструкции дают пространственную структуру с точностью до атома. Исследование, начатое еще в 1970-е годы, все лучше и лучше позволяет оценивать архитектуру биоорганических комплексов.
Люди, регулярно читающие статьи в топовых научных журналах, давно уже привыкли к многочисленным молекулярным изображениям. Но микроскопы не позволяют увидеть отдельные молекулы . Правда, существует микроскопия сверхразрешения, за которую в 2014 году дали Нобелевскую премию по химии , но и она не позволяет «разглядеть» отдельные атомы. Изучать строение биологических молекул с такой подробностью - удел структурной биологии , лидирующими методиками которой до недавнего времени считались рентгеноструктурный анализ (РСА) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Интересным методом также является атомно-силовая микроскопия , но герой нашего сегодняшнего рассказа другой: это криоэлектронная микроскопия , за разработку которой вручена Нобелевская премия по химии уже этого, 2017 года .
Визуализация сложных структур, прежде считавшихся «невидимыми» ввиду их малых размеров, позволила совершить множество фундаментальных прорывов. Один из них - прогресс в борьбе с вирусом Зика , (рис. 1), недавно вызвавшим пандемию одноименной болезни. Благодаря криоэлектронной микроскопии, в последние пять лет все более прочно входящей в «большую тройку» методов структурной биологии, удалось получить трехмерную модель этого коварного агента. Что, в свою очередь, положило начало поиску потенциальных мишеней для лекарственных веществ, способных справиться с болезнью.
Рисунок 1. Примеры некоторых белковых комплексов. а - Белковый комплекс, регулирующий циркадный ритм. б - Комплекс звукового сенсора уха, считывающий изменения давления и позволяющий нам слышать. в - Модель вируса Зика.
Краткий экскурс в историю микроскопии до 1975 года
Всю первую половину 20 века три самых известных биологических структуры - ДНК, РНК и белок - оставались белым пятном на карте биохимического мира. Было известно, что они есть в организме и играют важную роль в жизни клеток, но каково их строение - никто не имел ни малейшего понятия. Лишь в начале 1950-х годов знаменитая группа ученых из Кембриджа, включавшая Френсиса Крика, Джеймса Уотсона, Мориса Уилкинса и Розалинд Франклин, впервые попробовала облучать ДНК рентгеновскими лучами, что привело к открытию прославленной двойной спирали.
К кристаллографам относился поначалу и Ричард Хендерсон , получивший за свои ранние исследования пусть не Нобелевскую премию, но докторскую степень. Метод рентгеноструктурного анализа заключается в дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке, что помогает идентифицировать структуру молекулы. Но в то время он был еще далек от совершенства, хотя сегодня это один из основных способов изучения структуры вещества . Шагнув на 30 лет вперед, мы узнаем, что наука получила еще один способ расшифровывать строение биомолекул: в 1980-х годах для изучения структуры и динамики белков в растворе начали применять метод ядерного магнитного резонанса (и применяют до сих пор ).
Благодаря этим двум методам удалось накопить внушительные объемы информации по строению биологических молекул: на сегодня в базе PDB находится более 100 тыс. структур. Но, как это часто бывает, и у того, и у другого метода есть свои недостатки. Так, с помощью ЯМР можно визуализировать только белки, находящиеся в растворе, и размер их должен быть небольшим. А минус рентгеновской кристаллографии считывается в названии метода: он работает на стабильных структурах типа кристаллов, но не на динамических «живых» молекулах. Изображения, полученные с помощью этого метода, напоминают снимки первых в истории фотокамер: черно-белые и застывшие, не несущие в себе информации о подвижной структуре белка. Эта проблема заставила Ричарда Хендерсона бросить рентгеновскую кристаллографию в 1970-х, что и стало отправной точкой на его пути к Нобелевской премии 2017 года.
Шаг первый: бактериородопсин под прицелом электронного пучка
Хендерсона с самого начала интересовали мембранные белки. Почему же их визуализация оказалась неподвластна рентгеновскому методу на тот момент? Неудачи возникали при попытках кристаллизовать белок, тем самым нарушая его естественное состояние в липидной мембране клетки. Мембранные белки крайне трудно извлекать из мембраны, не нарушая их нативного состояния : очень часто они просто «слипаются» в единую массу, неподвластную дальнейшему изучению. Впрочем, сейчас и в кристаллизации мембранных белков есть большой прогресс: мембрану просто научились делать частью кристалла .
После ряда неудачных попыток Ричард Хендерсон обратился к единственному, казалось, реальному варианту: электронной микроскопии. В чем принципиальное отличие электронного микроскопа от оптического? В просвечивающей электронной микроскопии (так называется эта техника) вместо пучка света к образцу посылается луч электронов. Длина волны электронов намного меньше, чем длина волны света, поэтому с помощью электронного микроскопа можно визуализировать даже очень маленькие структуры - вплоть до уровня отдельных атомов.
В теории электронный микроскоп идеально подходил для исследований Ричарда Хендерсона - ведь он позволял получить изображения мембранных белков на атомном уровне. Но на практике эта идея казалась нереальной. Со времен изобретения электронного микроскопа считалось, что с помощью этого метода можно изучать исключительно неживую материю. Виной тому электронный пучок: он позволяет получать картинки с высоким разрешением, но фактически «сжигает» на своем пути живые структуры. Если же снизить его интенсивность, то изображение теряет контраст и получается нечетким.
Дополнительной преградой на пути визуализации биомолекул под электронным микроскопом является необходимость создания вакуума. При выкачивании воздуха из биологического образца испаряется и вода, обволакивающая живые структуры, из-за чего они теряют свою естественную форму. Таким образом, все обстоятельства выступали против Хендерсона. Однако его идею спас особый белок, обладающий исключительной стабильностью в мембране - бактериородопсин.
В 1991 году Йоахим Франк «заморозил» рибосомы по методу Дюбоше, получив на выходе изображение их трехмерной структуры. И, несмотря на то, что картинка была сделана в небывалом для электронной микроскопии разрешении, исследователям удалось показать лишь очертания рибосомы. Странные каплевидные структуры все еще не выдерживали сравнения с атомным разрешением рентгеновской кристаллографии. Криоэлектронная микроскопия позволяла визуализировать лишь неверные контуры электронной плотности, напоминающие пузыри, из-за чего этот метод в шутку называли «блобология» (blobology ) . Но прогресс идет вперед, и после 2010 года получил распространение новый тип электронного детектора - Direct Electron Detector , позволяющий получать гораздо более детальное изображение биологических структур .
Сегодня криоэлектронная микроскопия позволяет «ловить» биологические структуры «в динамике» на разных этапах. Совмещая полученные снимки, исследователям удается создавать целые фильмы, демонстрирующие перемещения и взаимодействия белков с другими молекулами. За последние пять лет чуть ли не каждая вторая молекулярная структура, опубликованная в журналах уровня Science и Nature , криомикроскопическая: это и новые состояния рибосомы , и АТФазы , и различные рецепторы , и филаменты загадочного тау-пептида , и инфламмосома , и термочувствительный ионный канал TRPV1 , и многое другое. И это только начало: ученым еще предстоит определить точную структуру и механизм работы множества белков и других сложных биологических структур.
Литература
- 12 методов в картинках: микроскопия ;
- По ту сторону дифракционного барьера: Нобелевская премия по химии 2014 ;
- 12 методов в картинках: структурная биология ;
- Атомно-силовая микроскопия: увидеть, прикоснувшись ;
- Fernholm A. (2017).
Нобелевская премия по химии в 2017 году была присуждена за развитие криоэлектронной микроскопии высокого разрешения для определения структур биомолекул в растворах. Лауреатами стали из Лозаннского университета, Иоахим Франк из Колумбийского университета и из Кембриджского университета.
Криоэлектронная микроскопия - это форма просвечивающей электронной микроскопии, в которой образец исследуется при криогенных температурах.
Метод популярен в структурной биологии, так как позволяет наблюдать за образцами, которые не были окрашены или каким-либо образом зафиксированы, показывая их в их родной среде.
При электронной криомикроскопии замедляется движение входящих в молекулу атомов, что позволяет получать очень четкие изображения ее структуры. Получаемые о строении молекул сведения чрезвычайно важны, в том числе, для более глубокого понимания химии и развития фармацевтики.
Многие прорывы в науке связаны с успешной визуализацией объектов, невидимых человеческому глазу. Оптическая микроскопия позволила доказать существование микроорганизмов, взглянуть на сперматозоиды и яйцеклетки, частично изучить клеточную структуру и даже разглядеть хромосомы. Преодолеть физические ограничения оптических телескопов позволила электронная микроскопия, где вместо светового потока использовался пучок электронов.
Однако и у нее были свои изъяны. Во-первых, мощный пучок электронов разрушал биологический материал. Во-вторых, чтобы разогнаться электронам необходим вакуум - соответственно, в вакууме должен был находиться и препарат.
Поэтому изучать с ее помощью «живые» образцы было невозможно.
Вклад Иоахима Франка способствовал широкому распространению метода. Еще в 1975-1986 годах он разработал метод обработки изображений, заключавшийся в анализе полученных с помощью электронного микроскопа двумерных изображений и построения на их основе трехмерных структур изучаемых объектов.
Жак Дюбоше предложил использовать для сохранения образцов быстро охлажденную воду. Охлаждение образцов как способ их сохранения рассматривалось учеными довольно давно. Однако при замерзании воды и образовании кристаллической решетки структура образцов разрушалась. А в жидком виде она испарялась в вакуумной камере электронного микроскопа, опять-таки приводя к разрушению изучаемых молекул.
Наконец, был найден способ обойти фазу кристаллизации и добиться того, чтобы вода переходила в стеклообразное состояние. Метод был назван витрификацией.
При витрификации вода оказалась способна предохранять молекулы от разрушения даже в вакууме.
Эти открытия дали мощный толчок развитию электронной микроскопии. В 2013 году ученые смогли рассмотреть даже отдельные атомы вещества.Такое высокое разрешение позволяет рассматривать рибосомы и митохондрии клеток, ионные каналы и ферментные комплексы.
В 2015 году журнал Nature Methods назвал одночастичную криоэлектронную микроскопию прорывным методом года.
Последние технические достижения в этой области позволили ученым отойти от метода рентгеновской кристаллографии, главный недостаток которой — необходимость кристаллизации белка, что может быть затруднительно для белков со сложной структурой. Научные журналы последних лет пестрят детальными изображениями поверхности вируса Зика и белков, вызывающих устойчивость к антибиотикам. В частности, удалось , как бактерии золотистого стафилококка противостоят действию антибиотиков и снимок структуры, с помощью которой коронавирусы проникают в клетки.
Несмотря на быстрый прогресс в этой области, стоимость оборудования и стандартизированные методы несколько замедляют повсеместное распространение технологии криоэлектронной микроскопии.
Среди претендентов на Нобелевскую премию по химии числился россиянин — ведущий научный сотрудник Института химической физики (ИХФ) им. Н. Н. Семенова , вместе с коллегами из США и он сделал весомый вклад в область углеродно-водородной функционализации — отрасли, разрабатывающей новые методы синтеза органических соединений. Также в списке возможных лауреатов значились датчанин Йенс Норсков за фундаментальные достижения в области гетерогенного катализа на твердых поверхностях и команда из химиков Тсутому Миясаки, Нам-Гю Парка и Генри Снейта за открытие минерала перовскита и разработки на его основе.
В 2016 году премия была Жан-Пьеру Соважу, Стоддарту и Бернарду Феринге за изобретение молекулярных машин.
По сложившейся традиции - Нобелевские премии 2017 года в «научных» номинациях достались не отдельным ученым, а группам исследователей, состоящим из 2-3 человек. А вот в двух "гуманитарных" дисциплинах награды оказались персональными.
Нобелевская премия по физике за 2017 г. за открытие гравитационных волн
Ее получили американские физики Райнер Вайсс (Rainer Weiss), Кип Торн (Kip Thorne) и Барри Бэриш (Barry Barish), под руководством которых в США был реализован проект LIGO.
Нобелевские лауреаты 2017 года: Райнер Вайс, Кип Торн и Барри Бэриш («Физика»)
Его главными элементами являются две обсерватории в штатах Вашингтон и Луизиана, удаленные друг от друга на 3002 км. Поскольку скорость распространения гравитационных волн равна скорости света, данное расстояние «гравитация» преодолевает ровно за 10 миллисекунд, что облегчает расчеты. Обсерватории представляют собой интерферометры Майкельсона, совмещенные с двумя мощными лазерами. Их использование позволяет установить направление на источник гравитационных флуктуаций и определить их силу.
Еще 14 сентября 2015 г. до Земли дошла гравитационная волна от столкновения двух массивных черных дыр, которые находились на расстоянии 1,3 млрд. световых лет от Солнечной системы. Ее то и удалось зарегистрировать с помощью обсерваторий LIGO, подтвердив тем самым экспериментально само наличие гравитационных волн. Необходимо отметить, что их существование предсказал еще Альберт Эйнштейн в далеком 1915 г. в рамках Общей Теории Относительности.
Но теория – это одно, а практика – совсем другое, решили в Нобелевском комитете и, совершенно заслуженно присудили премию трем американским физикам.
Открытие гравиволн - действительно фундаментально, поскольку способно стать отправной точкой для развития систем связи на основе гравитационного взаимодействия, а в далеком будущем – и создания транспортных средств для путешествий (в т.ч. межзвездных) через «изнанку пространства», которые многократно описаны фантастами.
Нобелевская премия по химии за 2017 г. за развитие криоэлектронной микроскопии
Была присуждена швейцарцу Жаку Дюбоше (Jacques Dubochet) из университета Лозанны, американцу Иоахиму Франку (Joachim Frank) из Колумбийского университета и британцу Ричарду Хендерсону (Richard Henderson) из Кембриджа.
Нобелевские лауреаты 2017 года: Жак Дюбоше, Иоахим Франк и Ричард Хендерсон («Химия»)
Несмотря на то, что они работают в разных организациях, ученые кооперировались друг с другом. В результате им удалось добиться небывало высокого разрешения изображений биомолекул, для чего они использовали особые растворы. Суть метода криомикроскопии заключается в быстром замораживании исследуемого биоматериала в жидком азоте или этане без его кристаллизации. Это позволяет увидеть вирус, митохондрию, рибосому или отдельный белок именно такими, какими они есть на самом деле. Используя электронные микроскопы и специальную методику визуализации, ученые создали карты целого ряда белков в разрешении порядка 2 Ангстрем (2 мкм).
На полученных изображениях можно различить отдельные атомы углерода или кислорода, входящие в состав белков и ферментных комплексов. Данное достижение невозможно переоценить, поскольку оно предоставляет биохимикам великолепный инструмент для исследований.
Как указано в пресс-релизе Нобелевского комитета, открытие трех лауреатов премии за 2017 г., - «переместило биохимию в новую эру».
Теперь структуру ДНК можно визуализировать не схематически, а иметь реалистичную картинку «as is», что наверняка поможет в достижении самых разных целей. Например, открываются отличные перспективы в оценивании воздействия лекарств на самые тонкие структуры организма, а также в генном модифицировании. Как ожидается, новые методы криоэлектронной микроскопии позволят сделать, возможно, решающий шаг в разработке лекарства от рака.
Нобелевская премия по физиологии за 2017 г. за исследование биологических ритмов
Досталась американским генетикам Джефри Холлу (Jeffrey Hall), Майклу Росбашу (Michael Rosbash) и Майклу Янгу (Michael Young).
Этим ученым удалось осуществить прорывное исследование в области т.н. «циркадных» циклов, отвечающих за периоды сна и бодрствования у всех живых существ на планете. В отличие от предшественников (а изучение биоритмов ведется еще с 18-го века), нобелевские лауреаты обнаружили особый ген, контролирующий биологические часы. В качестве объектов исследования были выбраны обыкновенные плодовые мушки, поколения которых сменяются всего за несколько суток, что очень удобно.
Биохимические эксперименты показали, что найденный ген кодирует специальный белок, причем в течение ночи это вещество накапливается в организме, а днем – постепенно разрушается.
Ученые тщательно проанализировали, как это происходит у дрозофил, а затем экстраполировали полученные данные на более сложные организмы, включая человека. Как выяснилось, биологические часы работают примерно одинаково у всех живых существ, регулируя целый ряд функций организма – температуру, давление, гормональный фон и в конечном итоге – циклы сна.
Полученные результаты обещают окончательное решение проблемы бессонницы, которая мучает десятки миллионов людей. Причем, средством против расстройств сна уже в скором времени будет не вредная химия, а абсолютно естественный для человека белок (если нужно бодрствовать) или его разрушитель (когда необходимо заснуть). Кроме того, открытие нобелевских лауреатов в недалеком будущем наверняка улучшит качество жизни людей, работающих в ночную смену или имеющих скользящий график.
Нобелевская премия по экономике за 2017 г. за изучение «поведенческой экономики»
Досталась американскому экономисту Ричарду Талеру (Richard Thaler) за разработку целого раздела экономической теории, который получил неофициальное название - «экономика с человеческим лицом».
Нобелевский лауреат 2017 года: Ричард Талер («Экономика»)
Эта дисциплина изучает нерациональное поведение людей и целых организаций, выбирающих товары и услуги. Давно известно, что факторами такого выбора являются не только прямая выгода, но и социальные, эмоциональные, когнитивные и даже религиозные аспекты. Все это не учитывается большинством современных экономических теорий, которые исходят из того, что в основе экономики лежит исключительно прямая выгода. Нобелевский лауреат 2017 г. убедительно обосновал ущербность такого подхода, а также доказал, что «полезность» может лежать не только в материальной плоскости, но и в области чувств.
Почему дорогие «айфоны» успешно конкурируют на мировом рынке с объективно не менее качественными, но дешевыми «самсунгами»? В т.ч. и на этот вопрос отвечает поведенческая экономика Ричарда Талера
В рамках поведенческой экономики Ричард Талер подробно исследовал такие моменты, как эвристика доступности, влияние толпы (ввел понятие «информационные каскады»), феномен избыточной уверенности, который заставляет людей делать объективно ошибочный выбор товара или услуги. Есть надежда, что новая экономическая теория «с человеческим лицом» позволит точнее прогнозировать развитие потребительских рынков и экономики в целом.
Нобелевская премия по литературе за 2017 г. за романы «невероятной эмоциональной силы»
Вручена британскому писателю японского происхождения Кадзуо Исигуро (Kazuo Ishiguro) за глубокое проникновение во внутренний мир людей, осознающих «иллюзорность своих связей с миром».
Нобелевский лауреат 2017 года: Кадзуо Исигуро («Литература»)
Как отмечают эксперты-литературоведы, в 2017-м году Нобелевский комитет наконец-то отказался от политизации премии по литературе, как это было, например, два года назад, когда «нобелевку» получила малоизвестная писательница Светлана Алексиевич. Не исключено, что главная ее заслуга, повлиявшая на выбор жюри – откровенно русофобские произведения и высказывания. В отличие от Алексиевич, Кадзуо Исигуро – действительно признанный мастер прозы, уже получавший Букеровскую премию и издавший свои произведения миллионными тиражами.
Его книга «Не отпускай меня» была включена в сотню лучших английских романов по версии журнала «Τime», а сразу несколько работ мастера были экранизированы, в частности, роман «Белая графиня». Последнюю свою книгу «Погребенный великан» Кадзую Исигуро написал в модном нынче жанре фэнтези, однако Нобелевскую премию получил не за него, а как бы по сумме результатов своего творчества, что вполне справедливо и заслуженно. Романы этого японо-британского писателя переведены на 40 языков, в т.ч. на русский.
Нобелевская премия Мира за 2017 г. за борьбу против ядерного оружия
Была вручена организации, которая называется «Международная кампания за запрет ядерного оружия» - в английской аббревиатуре ICAN.
Этот результат стал для многих неожиданным, поскольку ожидалось, что нобелевским лауреатом-2017 в области борьбы за мир станет папа римский Франциск или же канцлер Германии Ангела Меркель. Нобелевский комитет сумел удивить наблюдателей, в последний момент сделав выбор в пользу ICAN. Данная организация объединяет политиков, общественных деятелей, а также простых людей из 101-й страны мира и ставит целью полный запрет ядерного оружия на Земле.
ICAN регулярно проводит массовые акции против нуклеаризации планеты, ведет разъяснительную работу и лоббирует антиядерные законы в различных странах. Конечная цель организации – мир без ядерных бомб, выглядит несколько утопично, но возможно это и стало причиной присуждения ICAN Нобелевской премии Мира.
На прошлой неделе было объявлено, что Нобелевскую премию по химии 2017 года получат швейцарец Жак Дюбоше, американец немецкого происхождения Йоахим Франк и шотландец Ричард Хендерсон за «разработку методов криоэлектронной микроскопии высокого разрешения для определения трехмерных структур биомолекул в растворе». Их работы позволили, начиная с 80-х годов прошлого века, опробовать и постепенно усовершенствовать этот вид микроскопии до такой степени, что в последние годы ученые могут рассматривать сложные биологические молекулы в мельчайших деталях. Нобелевский комитет отметил, что метод криоэлектронной микроскопии перевел биохимию в новую эру, позволяя заполнить множество пробелов в знаниях о молекулах жизни и живых системах.
Сразу отметим, что вряд ли можно называть криогенную электронную микроскопию принципиально новым и самодостаточным методом физического исследования вещества. Скорее, она является разновидностью просвечивающей электронной микроскопии (один из авторов этого метода, Эрнст Руска , получил Нобелевскую премию в 1986 году), которую специально адаптировали для изучения микробиологических объектов.
В просвечивающем электронном микроскопе через достаточно тонкий образец, чтобы он был прозрачным для электронов (обычно это десятые и сотые доли микрона), пропускают пучок электронов, которые, проходя через образец, поглощаются и рассеиваются, меняя направление движения. Эти изменения можно зарегистрировать (сейчас в качестве детектора чаще всего используется ПЗС-матрица , создатели которой, Уиллард Бойл и Джордж Смит , стали лауреатами ) и, после анализа, получить изображение исследуемого объекта в плоскости, перпендикулярной пучку. Поскольку собственная длина волны электронов (десятки пикометров при энергиях, характерных для электронных микроскопов) много меньше длин волн света в видимой области (сотни нанометров), с помощью электронной микроскопии можно «разглядеть» гораздо более тонкие детали, чем с помощью оптической микроскопии, в том числе и флуоресцентной микроскопии высокого разрешения (ФМВР), разработанной лауреатами Эриком Бетцигом , Штефаном Хеллем и Уильямом Мернером .
Предельная разрешающая способность электронных микроскопов - несколько ангстрем (десятые доли нанометра) - уже почти достигнута. Это позволяет получать изображения, на которых, например, различимы отдельные атомы. Для сравнения: предел возможностей ФМВР - 10–20 нм. Но просто так сравнивать разные методы по предельному разрешению довольно бессмысленно. Электронные микроскопы имеют высокое разрешение, но им не всегда можно воспользоваться. Дело в том, что образец, помимо измельчения при подготовке, во время самого исследования подвергается довольно серьезному облучению пучком электронов (грубо говоря, чем интенсивнее пучок, тем меньше ошибок и тем лучше получается результат), находясь при этом в вакууме (вакуум нужен, чтобы среда не рассеивала электроны вне образца, внося тем самым лишние искажения). Такие условия совершенно не подходят, если нужно изучать сложно устроенные биологические молекулы и объекты - они повреждаются в разреженной среде и в них много довольно слабых связей, которые просто будут разрушаться во время исследования.
Понимание того, что без дополнительных усовершенствований электронный микроскоп нельзя будет приспособить к изучению биомолекул и живых систем, появилось почти сразу после его изобретения. Об этом, например, писал спустя три года после демонстрации принципа работы электронного микроскопа Эрнстом Руской в 1931 году венгерский физик Ладислав Мартон (L. Marton, 1934. Electron Microscopy of Biological Objects). В той же статье Мартон предложил и пути решения этой проблемы. В частности, он же указал, что замораживание образцов может снизить ущерб от облучения пучком электронов. Важно отметить, что, хотя в статье Мартона это и не указано, замораживание образца помогает еще и тем, что снижает тепловое колебание молекул, что тоже способствует улучшению получаемого изображения.
В 1970–80-е годы наука и техника достигли достаточного уровня развития, чтобы преодолеть все трудности. И это произошло во многом благодаря усилиям лауреатов премии этого года.
Ричард Хендерсон был первым, кто получил при помощи просвечивающей электронной микроскопии (с охлаждением образца) изображение несимметричного белка с атомным разрешением. Свои исследования он начал еще в середине 70-х годов. Причем сперва Хендерсон пытался получить структуру нескольких белков из клеточной мембраны, используя метод рентгеноструктурного анализа , который уже тогда мог давать разрешение в несколько ангстрем. Однако быстро стало ясно, что этим способом хорошего результата не добиться: исследуемое вещество должно быть в кристаллической форме, а мембранные белки, извлеченные из своего окружения, либо плохо кристаллизуются, либо вообще теряют форму. Тогда он переключился на электронную микроскопию.
Был выбран конкретный белок - бактериородопсин - и было решено не извлекать его из мембраны, а исследовать прямо в ней. Ученые дополнительно покрывали образцы раствором глюкозы, чтобы защитить его от высыхания в вакууме. Это помогло решить проблему с сохранением структуры. Затем Хендерсон с коллегами столкнулись с уже описанной проблемой разрушения образцов под действием пучка электронов. Ее помогло решить сочетание нескольких факторов.
Во-первых, бактериородопсин располагается в мембране регулярно, поэтому аккуратный учет этой регулярности в сочетании со съемкой под разными углами сильно помогает при построении картинки. Это помогло снизить интенсивность пучка и сократить время экспозиции, но выиграть в качестве. Уже в 1975 году удалось получить изображение этого белка с разрешением 7 ангстрем (рис. 3, см. R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy).
Во-вторых, у Хендерсона была возможность ездить по разным научным центрам и пробовать разные электронные микроскопы. Поскольку в те годы не было унификации, у разных микроскопов были свои достоинства и недостатки: разная степень вакуумирования камеры, разная степень охлаждения образца (это позволяет снизить ущерб от облучения электронами), разные энергии электронных пучков, разная чувствительность детекторов. Поэтому возможность исследования одного и того же объекта на разных микроскопах позволила сначала подобрать «наименее неблагоприятные» условия получения изображения, а потом постепенно их улучшать. Так Хендерсон накапливал данные и получал все более и более точную структуру бактериородопсина. В 1990 году вышла его статья, в которой была представлена модель этого белка с атомарным разрешением (R. Henderson et al., 1990. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy).
В ходе этого пионерского исследования Хендерсон показал, что криоэлектронная микроскопия может давать изображения с разрешением, которое не хуже, чем у метода рентгеноструктурного анализа - в то время это было прорывом. Правда, этот результат существенно использовал тот факт, что бактериородопсин регулярно располагается в клеточной мембране, и не было понятно, можно ли будет добиться такого разрешения для других, «нерегулярных» молекул.
Проблему обработки слабых сигналов от беспорядочно расположенных биологически активных молекул решил другой лауреат Нобелевской премии 2017 года - Йоахим Франк. Его главный вклад в криоэлектронную микроскопию состоит в создании алгоритмов анализа двумерных изображений, получаемых с помощью криоэлектронной микроскопии, которые позволяют построить качественную трехмерную модель. Подобные алгоритмы уже были разработаны для других методов микроскопии. Франк оптимизировал и во многом уточнил методы математического анализа, позволяющие отделить полезную информацию, полученной в ходе электронной микроскопии, от сигналов, обусловленных шумом. Шумы возникают в точных электронных приборах по разным причинам: случайные колебания силы тока и напряжения могут быть из-за неравномерного испускания электронов в электровакуумных блоках, неравномерности процессов образования и рекомбинации носителей заряда (электронов проводимости и дырок) в полупроводниковых блоках, теплового движения носителей тока в проводниках (тепловой шум), либо внешних наводок (несмотря на то, что все обычно хорошо заизолировано).
Задача усложняется еще и вот чем. Если объекты, пусть даже и одинаковые или примерно одинаковые, как должно быть в подобных исследованиях, неупорядоченны, то они дают немного разные по структуре сигналы, которые могут размывать друг друга. Причем причину такого размытия - шум это или ошибки алгоритма - определить непросто. Схематично принцип обработки данных показан на рис. 5: многочисленные плоские изображения исследуемой молекулы очищаются от шумов и типизируются по «ракурсам», затем из изображений с близкими ракурсами строится более качественный профиль, и, наконец, из этих профилей строится трехмерная модель.
В 1981 году Франк обобщил математические модели в первой версии компьютерной программы SPIDER (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields - Система для обработки данных электронной микроскопии и связанных областей, первая публикация: J. Frank et al., 1981. Spider - A modular software system for electron image processing). Этот программный пакет существует и обновляется до сих пор, более того, эти программы свободны к распространению, что, безусловно, облегчает работу ученых во всем мире. Франк использовал собственные алгоритмы для получения изображения поверхности рибосомы - состоящего из нитей РНК и связанных с нею белков органоида клетки, служащего для биосинтеза белка из аминокислот на основе генетической информации.
Приставка «крио-» появилась в электронной микроскопии благодаря третьему лауреату - Жаку Дюбоше. Он разработал метод быстрого охлаждения водных растворов с образцами (J. Dubochet, A. W. McDowall, 1981. Vitrification of pure water for electron microscopy). Причем вода должна замерзнуть так быстро, чтобы молекулы не успели выстроиться в кристаллическую решетку, застывая как попало (см. аморфный лед). Это достигается путем быстрого погружения тонкой пленки раствора с образцом в емкость с жидким этаном, охлажденным до –160°С (рис. 6). Правильный способ заморозки можно назвать ключом к успеху всего метода, так как упорядоченные кристаллы льда могут вызывать дифракцию электронов, искажая информацию об изучаемых молекулах. Из-за большой молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот эти молекулы неповоротливы, так что при мгновенной заморозке они не успевают ни изменить свое положение, ни поменять форму. То есть строение биологически активных молекул при быстрой заморозке этим методом не меняется. Пользуясь им, Дюбоше впервые применил криоэлектронную микроскопию для изучения строения вирусов (рис. 7, см. M. Adrian et al., 1984. Cryo-electron microscopy of viruses).
В течение 1990-х и 2000-х годов криоэлектронная микроскопия постепенно развивалась и совершенствовалась с развитием вычислительных мощностей и точности приборов. Но настоящий расцвет криоэлектронной микроскопии начинается с 2012 года. Он связан с появлением прямых электронных детекторов на основе КМОП (CMOS), которые могут напрямую улавливать электроны, прошедшие сквозь образец. Это позволило упростить конструкцию электронных микроскопов, убрав сложные системы фокусировки и преобразования сигнала и уменьшив число узлов, которые могут внести случайный шум. В результате разрешающая способность метода криоэлектронной микроскопии повысилась до 2–3 ангстрем (рис. 8).
Одним из примеров практического применения криоэлектронной микроскопии в этой области можно считать изучение вируса Зика (рис. 10). Во время вспышки эпидемии Зика в Бразилии в 2016 году исследователям хватило несколько месяцев для получения информации о строении вируса методом криоэлектронной микроскопии (D. Sirohi et al., 2016. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus).
Другой пример - в этом году криоэлектронная микроскопия позволила получить структуру капсида самого большого представителя семейства вирусов герпеса - цитомегаловируса человека (X. Yu et al., 2017. Atomic structure of the human cytomegalovirus capsid with its securing tegument layer of pp150). Результаты исследования стали основой для поиска возможных участков капсида вирусов, которые могут стать молекулярными мишенями для противовирусных лекарств.
Аркадий Курамшин
